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VHP灭菌工艺与设备探索

更新时间:2017-08-01

 摘要:探讨过氧化氢灭菌工作原理,VHP灭菌与现有灭菌工艺比较及灭菌结果验证;介绍空间灭菌与传递窗、隔离器、冻干机等灭菌各自的要点。
关键词:过氧化氢   工作原理   VHP灭菌  消毒  灭菌工艺


一、前言
一直以来灭菌都是无菌产品生产的关键环节,随着新版GMP的实施和推广,对无菌药品的生产要求的不断提高,为了提高药品的质量,为了中国人民的健康,选择有效、安全、环保的灭菌方式显得至关重要。
在各种灭菌技术中,气化过氧化氢灭菌技术逐渐被使用者公认为最理想的灭菌方式,气化过氧化氢(VHP)消毒、灭菌技术正迅速成为制药、生物技术和医疗卫生行业生物进化方式方法的选择,对于生物指示剂(BI)-嗜热芽孢杆菌(ATCC12980)能够达到6log的杀灭率,灭菌时间短,见效快。目前这种灭菌技术已经广泛应用于制药、生物科技、生物医药、卫生保健、生物、食品和环境保护等诸多领域。
二、VHP灭菌工作原理
过氧化氢因具有氧化还原作用而具有杀菌效果,特别对嗜热芽孢杆菌杀灭效果好;过氧化氢的作用原理是通过复杂的化学反应解离出具有高活性的羟基;双氧水经过加热,很容易分解出羟基自由基(-OH),其具有很强的氧化作用,可破坏菌体的细胞膜及蛋白质、氨基酸、酶和DNA而致使微生物死亡。如图1;

图1、过氧化氢灭菌原理
三、VHP灭菌与现有灭菌工艺的比较
1、VHP的特点
VHP灭菌是低温灭菌工艺,在灭菌周期完成后残留物很少(无需再次清洁)且无毒副产品残留,符合法规要求和工艺控制,工艺十分容易验证,在低气体浓度(1~2mg/L=1000ppm)下对大多数微生物灭菌效果很好,灭菌所需的时间很短,大大节约了灭菌成本,而且VHP灭菌非常环保,对人类健康和安全有所保障。
2、甲醛熏蒸的特点
甲醛熏蒸是通过加热汽化甲醛或福尔马林,作用比较慢,需要长时间的熏蒸,熏蒸完后有结晶状白色粉末残留,清理比较麻烦且不彻底,灭菌程序十分难以验证,甲醛属于剧毒化学品且被归类为“Class A”致癌和导致细胞变异的物质,随着对人类健康水平要求的提高,甲醛被限制作为洁净室灭菌剂使用将成为必然,因此甲醛必须被取代。如图2;

图2、甲醛与气化过氧化氢灭菌比较
3、臭氧灭菌的特点
臭氧具有极强的氧化还原性和腐蚀性,人体吸入后会造成不可逆的损害,臭氧的分解速度非常快,复杂的空间灭菌效果很差。
四、决定VHP灭菌周期的因素
对于VHP的周期开发主要取决于以下因素:被灭菌空间的温度(4-80℃)和相对湿度(20-65%)。至于灭菌是否有效,和相对湿度有绝对的关系,相对湿度必须维持在80-95%之间;太高(超过100%)会造成冷凝,小的腔体或空间甚至会产生水雾,如果用于房间,太长时间还可能破坏房间内的材料(如彩钢板或地面);太低(低于80%)就完全没效果,不能灭杀芽孢杆菌。
环境湿度如果太高,VHP就没法气化很多的双氧水,也就达不到灭菌效果。假设房间相对湿度是80%,那么我们又设定相对湿度RH不能超过95%,那么打进空间的双氧水汽就会很少,也就达不到灭菌效果。
最好的相对湿度曲线就是由45%开始,在打入气化过氧化氢后,相对湿度持续升高至85%,并在灭菌阶段维持在80-95%间,这样能保证不凝结,同时能达到微生物减少6个对数的效果(D-值);在排气阶段采用过滤过的洁净空气置换气化过氧化氢,直到浓度降至1 ppm以下。因此相对湿度曲线是梯形为最好。
五、灭菌介质的选用
采用浓度为30% / 35% /50%的双氧水。由于双氧水是个强氧化剂,因此采用50%的双氧水,风险较大,建议采用30%或35%的电子级双氧水,不含稳定剂,蒸发后无白色粉末生成。
六、高、低浓度监测
无论是Draegger德尔格或ATI的探头,均可以在“潮湿”的情况下测到双氧水浓度,VHP浓度探头的误差率在±25%,这样的数字对于验证没有任何价值,其数值只是作为参考罢了。
另外探头放置的位置需要在被灭菌空间内,不能在管道上,特别是在一个所谓的“小室”内,因为这需要气体能扩散到“小室”内,同时这也只是显示气体在管道(小室)内的情况,反映的不是工作室内的VHP浓度(工作室的浓度会渐渐上来,但是管道只能是反映当时在管道上进来的气体浓度),这在验证上是没有意义的。 低浓度探头不能放在工作室内,因为在高浓度灭菌时,高浓度的气化过氧化氢会“污染”低浓度探头,会导致其失效。探头每隔6个月就得校验一次,校验后使用大约半年就失效,因此这是个昂贵的消耗品。同时校验高浓度探头用的不是采用气化双氧水,采用的是氧化硫SO2,这个校验方式采用的是不同化学品,校验没有任何参考价值。那么如何测气化过氧化氢的浓度?可以在排风管道上(这才可以测到工作室的浓度)安装个取样阀门,采用ATI或draegger德尔格的pump,采用人工的方式,每隔一段时间取气体的样本分析浓度,这样就可以做气体浓度的验证。灭菌效果取决于相对湿度,不是浓度,RH必须达到80-95%,形成微小的双氧水滴,才有灭菌效果。即使是50ppm,一个小时,也能达到减少6log的效果,因此浓度实在不是决定因素。
七、验证方式
采用生物指示剂Bio indicator(简称BI)及化学指示剂chemical indicator(简称CI)。
BI是用于验证灭菌效果,客户可以选择4log,5log及6log的指示剂。
CI主要是pH值指示剂,用于验证气化过氧化氢是否达到了该角落。
因此指示剂需要贴在“死角”,比如房间的四个角落的上下和房间的中央,基本上10到30套的指示剂就够了。隔离器或者小的空间也大约贴10套就可以了。
可以在隔离器或房间内放置ATI或德尔格的高浓度探头,监察气化过氧化氢的浓度(作为参考和验证需要(但是验证主要靠BI);至于低浓度探头,在排风一段时间后才通过快接口伸入低浓度探头。
我曾经看到欧洲一些专家是在排风管(软管)上钻个洞,伸入VHP浓度探头。我认为这样才对,因为如果通过快接伸入被灭菌空间,有可能破坏其洁净,有二次污染的风险。因此在排风软管上取样是正确的选择。
BI为一片不锈钢片,上面有个凹槽,内有嗜热芽孢杆菌,外面包了一层呼吸带包装。使用时要折成L型,用贴纸贴在相关的位置,呼吸口朝上,让气化过氧化氢能够覆盖到指示剂的两边。周期结束后,小心收集指示剂到一个无菌的玻璃瓶或自封袋,接着放到培养基内,在55℃的温度下培养一周。正常指示剂能够在12个小时就培养出来结果。但还是要遵循法规,按照规定时间培养。
八、VHP灭菌器介绍
在工业领域产品无菌的首要条件是房间必须净化。比如制药业,生物或食品业。VHP过氧化氢气体发生器用于表面消毒并被设计和计划用于净化洁净室,隔离器,产品转让等等。过氧化氢流通不是很快并受工艺控制,它可以选择其他的方法融入周围的环境。VHP灭菌器采用单通道、双气流技术;源源不断的新的气化过氧化氢供应,流量大,适合大面积的洁净室灭菌;消耗少:每分钟只需5克H2O2,5升就可供8小时使用;维护方便:大部分零件均可在市面上购到;服务便利:便携式H2O2浓度探测仪,可就地校验,多余的探头可做交叉校验使用;15年的经验,能针对客户任何要求,提出解决方案;设备体积小,移动及操作方便。

图3、灭菌器示意图
九、VHP灭菌器维护与保养
1、一般说明:不能存放任何工具在气体发生器内;必须小心移动,在气体发生器附近不能存放垃圾,报纸,纸巾和干净的布料等等,这些东西可能吸收了H2O2会引发不受控制的火灾;定期检查和维护。
2、日常保养:清除不锈钢表面剩余的过氧化氢;检查过氧化氢容器是否有足够的溶液;确保气体排放口紧密的连接到管道。
3、月度保养:目视检查高效过滤器,如损坏或堵塞,请更换;检查泵的硅胶管是否紧密和损坏;目视检查仪器仪表腐蚀和损坏。
4、半年保养:泵每运行100个小时需更换泵的软管(定时器在触摸屏或电控柜);用蒸馏水清洗蒸发器腔体;检查泵的回流功能;检查天平秤,如果有需要的话,进行再校准;测试所有报警。
5、年度保养:检查热风喷射器与风机;检查高效过滤器,如有需要,更换;检查过氧化氢泵的磨损和损坏;检查电器装置有无腐蚀和损坏。                                                                              
十、常见故障维修
1、灭菌浓度不高:检查调整蠕动泵的流量控制;检查加热器温度;查看参数设置。
2、蒸发器达不到温度:检查加热器有无损坏;检查温度传感器/温控开关是否损坏。
3、双氧水重量报警:检查双氧水桶中液体量,如不够请添加;拿掉双氧水桶,观察天平秤是否显示为零,如不是请归零。
4、蠕动泵不工作:检查蠕动泵接线,查看有无信号输出;更换蠕动泵。
十一、VHP的应用
1、VHP房间灭菌
首先要确认被灭菌房间的布局情况,包括:空间大小、房间数量、内部设施。
根据被灭菌房间的布局情况,分别进行:
(1)房间内所有物品的材料测试,测试方法分为两种:a)现场极限测试:采用湿法闷的方法,省略常见的耐受双氧水的材质测试,对一些特殊材质进行测试,主要针对彩钢板及油漆相关材质进行测试;b)多余边角料测试:将房间同类型材质的边角料放置于VHP传递窗或灭菌柜内使用高浓度反复熏蒸48h或以上,观察其材质情况。以上两种方法建议使用第一种。
(2)CI测试:将CI放置于房间各个“死角”,按照VHP发生器的理论产气能力(风量)计算充满房间所需时间,正常计算公式为:
H1(测试用时min)=V1(房间实际大小)÷Q1(风量换算成m³/min)+H2(20min-损耗)                                                     (1)
例如:房间大小为400m³,灭菌器产汽能力(风量)为500m³/h,那H1=400÷(500÷60)+20 ≈ 68min。
(3)周期开发:首先制定周期开发方案,描述灭菌操作过程,灭菌需要的仪器设备及灭菌后的验证;灭菌结束后提交灭菌报告,包含灭菌过程中浓度及温湿度记录数据,通过培养菌群,判定灭菌是否合格。
(4)BI测试:将BI放置于房间各个“死角”,灭菌结束后,先将生物指示剂中菌群放到培养基中,再放入到恒温的培养箱中培养一周,与阳性BI作对比,得出灭菌是否合格结论,结果填入灭菌报告中。
2、传递窗灭菌
许多药厂等企业需要从低级别房间传递物品到高级别区,对不能采用高温灭菌的物品来说,最好的传递方式是采用VHP传递窗。VHP传递窗是把气化过氧化氢发生器整合到传递窗中。通过高浓度探头及温湿度探头监测腔室内,VHP的浓度、相对湿度及温度;通过CI、BI验证浓度分布及灭菌效果,有效的保护不耐高温物品,清除楚物品表面的细菌。
3、隔离器灭菌
根据GMP及国家法律法规要求,对药物的无菌检验越来越严格,致使药厂及实验室需要改造隔离器。改造实验室或重新采购无菌检验隔离器成本大大增加,如采用VHP给隔离器灭菌,即降低成本又能满足法律法规要求。隔离器灭菌方法如下:增加VHP气体注入管道,增加排气阀门及风机;当需要灭菌时打开VHP灭菌器及进气阀门,打开排气阀门及风机,灭菌结束后关闭即可。通过CI、BI验证浓度分布及灭菌效果,验证方便且满座GMP要求。
4、冻干机灭菌
采用VHP灭菌器给冻干机灭菌时,连接进排气管道,通过三次脉动真空,破真空时注入VHP气体,即可完成灭菌,方法简单实用,成本低下。
十二、结论
 通过阐述VHP灭菌原理及灭菌应用可以看出,过氧化氢灭菌将成为药厂、实验室、奶制品行业等的首选。过氧化氢灭菌不仅满足法律法规要求,残留极易分解成水和氧气,不会对人体及环境产生危害。过氧化氢灭菌的比甲醛熏蒸更容易验证,通过生物指示剂BI就可验证灭菌的结果。
 
 
参考文献:
[1] 《中国药典》2015版“附录XVII灭菌法”
[2] 卫生部规定《消毒技术规范》
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